Metoder för DNA-, RNA- och proteinanalys
🧬

Daniel Fürth
Assistant professor
SciLifeLab/Uppsala University

🔗 furthlab.xyz
@furthlab

📽 Presentationen finns online 🌎

Länk: 🔗www.furthlab.xyz/teaching

📚🙇🏽‍♀️🙇🏻‍♂️📖 Inlärningsmål

Ämnen som behandlas idag:

• 🧬 DNA och kloning:
  • Restriktionsenzymer och endonukleaser
  • Rekombinant DNA
  • Kloning
  • RNA och cDNA genom reverse transcription

☕️ PAUS

• 🧬 Analytiska tekniker för nukleinsyra:
  • Elektrofores
    
  • Hybridisering
  • PCR
  • Sanger sequencing
  • Next-generation sequencing

☕️ PAUS

• 🧬 Analytiska tekniker för proteiner:
  • Affinitets-baserade
  • Masspektrometri

🛠🧰 Restriktionsenzymer 🧬

🇺🇸 Restriction och modifikations-enzymer 🇨🇭

Nobelpris: 🇺🇸 Hamilton O. Smith, 🇺🇸 Daniel Nathans, and 🇨🇭 Werner Arber.

Left to right: 🇨🇭Grete Kellenberger, 🇨🇭 Werner Arber, 🇨🇭 Daisy Dussoix

🛠🧰 Restriktionsenzymer 🧬

• Blunt ends

• Sticky ends

Rekombinant DNA

Ligering av sticky och blunt ends

Kloning

DNA bibliotek

RNA och cDNA

Break

☕️

📚🙇🏽‍♀️🙇🏻‍♂️📖 Inlärningsmål

Ämnen som behandlas idag:

• 🧬 DNA och kloning:
  • Restriktionsenzymer och endonukleaser
  • Rekombinant DNA
  • Kloning
  • RNA och cDNA genom reverse transcription

☕️ PAUS

• 🧬 Analytiska tekniker för nukleinsyra:
  • Elektrofores
    
  • Hybridisering
  • PCR
  • Sanger sequencing
  • Next-generation sequencing

☕️ PAUS

• 🧬 Analytiska tekniker för proteiner:
  • Affinitets-baserade
  • Masspektrometri

Elektrofores och separationskemi

Electrophoretic machine as designed by Tiselius

Elektrofores

Agarose gel electrophoresis

Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)

• Length
• Charge
• Confirmation

Molecules can be run in their “native state”
preserving higher-order structure.

Or a chemical denaturant can be added to
remove structure (urea for 🧬).

Native vs non-native PAGE.

Pore size controled by % of acrylamide.

📏 Resolution:
100-1000 nt down to single-nucleotide.

DNA hybridisering

• Denaturering: separering av vätebindningar mellan dubbelstrandade nukleinsyror (DNA/RNA).
• Annealing: Vätebindninga skapas mellan två enkelsträngade (single strand) nukleinsyror (DNA/RNA).

Melting temperature: temperaturen då 50% av ett DNA duplex dissocierar och blir enkelstrandat (single stranded).

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Design av PCR Primers

Design av PCR primers

Primers för: - Nucleocapsid - N1 - N2 - N3 - RNase P

Sekvensering av SARS‑CoV‑2

Design av PCR primers

Design av PCR primers

Design av PCR primers

Mänsklig RNase P - den positiv kontrollen

🧬 Tidslinje

• Dec 2019: Ovanlig lunginflammation upptäcks i Wuhan
  
• 31 dec 2019: Kina rapporterar till WHO
  
• 3–5 jan 2020: Yong-Zhen Zhangs grupp (Fudan Univ.) sekvenserar viruset
  
• 10 jan 2020: Första genomet publiceras (MN908947)
  
• 12 jan 2020: WHO bekräftar nytt coronavirus (SARS-CoV-2)
  
• Jan–feb 2020: CDC utvecklar RT-qPCR-test
  
• 12 feb 2020: CDC stoppar testet efter felrapporter

⚙️ CDC:s (center for disease control) två primerfel

1. N3-kontaminering (virusdetektion)

• N3-primers gav signal i negativa kontroller
  
• Orsak: kontaminerade reagenser vid tillverkning (PCR amplicon av SARS-Cov som kommit in i tuberna)
• Konsekvens: falskt positiva tester → försenad utrullning

2. RNase P-designfel (intern kontroll)

• Båda primrar i samma exon → amplifierar även DNA
  
• RP kunde bli positivt trots misslyckad RNA-extraktion
  
• Konsekvens: risk för falska negativa provresultat

Konsekvenser av att inte lyssna på PCR föreläsningar

• CDC:s testfel försenade nationell testning med ~3–4 veckor
  
• Virus spreds oupptäckt i flera delstater under februari 2020
  
• Tidig testning hade kunnat minska smittan med 60–80 %
  
• Uppskattningsvis tiotusentals dödsfall kan ha undvikits
  
• Felet bidrog indirekt till att USA tappade kontrollen tidigt

Sanger sequencing

Dideoxynucleotides (ddNTP) inkorporeras av DNA polymeras

• Polymeras kan inkorporera ddNTPs (dideoxynukleotider) och inte enbart dNTPs (deoxynukleotider).

• Enbart en kvävebas inkorporeras, sen termineras polymeriseringen.

• Ingen fri 3’hydroxyl grupp (3’OH).

🏆 Chain-termination method 🏅

“Sanger sequencing”

Second Noble Prize

Next-generation sequencing

• Solid support: PCR bridge amplification
• Primer extension: Reversible dye-terminators (patent 444 about to expire!)

Next-generation sequencing

Next-generation sequencing

All about how to massively multiplex sequencing.

Solid-phase substrate

• Bridge amplification

Primer extension

• Sequencing by synthesis
  (SBS)
• Reversible dye-terminators

Democratization of sequencing

Break

☕️

Analytiska tekniker för proteiner

Aminosyror

Peptidekedjor

Peptidkedja = amid-koppling (Eng. amide bond)

Affinitetsbaserade protein metoder

Dessa metoder är ej bra beskrivna i läroboken.

Antikroppar:

• Monokonala: härstammar från en och samma cellklon.
• Polyklonala: härstammar från flera cellkloner.

Western blot: Relativ mängd och molekylmassa kan läsas av från SDS-PAGE.

Immunohistochemistry (IHC): Binding av antikroppar direkt i vävnadssnitt (histologi) för visualisering under mikroskop. Standard inom klinisk patologi.

ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Görs på plattor med en färgreaktion som indikerar koncentrationen av antigen. Eva Engvall och Peter Perlmann (1971), Stockholms Universitet.

Masspektrometri