DNA replikation
och reparation
🧬

Daniel Fürth
Assistant professor
SciLifeLab/Uppsala University

🔗 furthlab.xyz
@furthlab

📽 Presentationen finns online 🌎

Länk: 🔗www.furthlab.xyz/teaching

Cell division

Mutationer kan få stora konsekvenser

🧬🩸 Sicklecellanemi 💉

🧬 Repetera från gymnasiet

🧬 Repetera från gymnasiet

5’ → 3’ Directionality

🧬 Repetera från gymnasiet

5’-ATCGTAGCTAGCTAGC-3’ top/plus strand
   ||||||||||||||||
3’-TAGCATCGATCGATCG-5’ bottom/minus strand

📚🙇🏽‍♀️🙇🏻‍♂️📖 Inlärningsmål

Ämnen som behandlas idag:

• 🧬 DNA replikation:
  • DNA replikering är semikonservativ.
  • Replikationsgaffeln
  • Korrekturläsning av DNA polymeras (eng. proof-reading)
  • Leading vs lagging strand
  • Primas och priming
  • Enzymerna i replikationsmaskinen
  • Telomeras
• ☕️ PAUS
• 🧬 DNA reparation:
  • Single-strand breaks:
    • Mismatch repair
  • Double-stranded breaks:
    • NHEJ: Non-homologous end joining
    • Homolog rekombination

🧬 DNA replikering är semikonservativ.

Tre modeller för DNA replikering.

🧬 DNA replikering är semikonservativ.

• Ena strängen bevaras alltid = semi-konservativ (till hälften bevarande).
• Watson & Crick (1953)
• Meselsons & Stahl (1958)
• E. Coli med NH₄Cl som ända kvävekälla. N¹⁴ eller N¹⁵.

🧬 DNA replikering är semikonservativ.

• Ena strängen bevaras alltid = semi-konservativ (till hälften bevarande).
• Watson & Crick (1953)
• Meselsons & Stahl (1958)
• E. Coli med NH₄Cl som ända kvävekälla. N¹⁴ eller N¹⁵.

Meselsons & Stahl (1958)

🧬 DNA replikering börjar alltid på samma ställe.

• Initiator proteiner binder till replication origin och öppnar upp strängen.

• Två replikationsgafflar formas.

• Replikation sker i båda riktningarna (bidirectional).

🧬 DNA polymeras.

Syntes: 5’ ➡ 3’

5’phos på dNTP till 3’OH på nascent strand.

🧬 DNA polymeras katalyserar fosfodiesterbindningar

• DNA-polymeraser kräver en mallsträng och använder deoxynukleotidtrifosfat (dNTP) som byggstenar

• dNTP består av en deoxynukleosid (t.ex. dATP, dTTP, dCTP eller dGTP) kopplad till tre fosfatgrupper.

• När polymeraset fogar in nukleotiden i DNA-strängen bildas en fosfodiesterbindning mellan 3′-OH-gruppen på den växande strängen och 5′-fosfatgruppen på dNTP:t.

• Vid denna reaktion klyvs två fosfatgrupper (som tillsammans kallas pyrofosfat, PPᵢ) bort, medan den kvarvarande fosfatgruppen blir en del av DNA-ryggraden.

• Pyrofosfatet hydrolyseras snabbt till två oorganiska fosfat (2 × Pᵢ), vilket gör reaktionen irreversibel och driver DNA-syntesen framåt.

dATP versus ATP

• ATP som används som energi i cellen har en 2’OH grupp.
• DNA saknar 2’OH grupper men RNA har dessa.

dATP versus ATP

• dNTPs saknar 2’OH grupp (dideoxy Nucleotide Tri Phosphates)

Fosfodiesterbindningar

• 3’OH binder med 5’phos
• Kan skapas av:
  • DNA polymeras
  • DNA ligase

dNTP som byggstenar och DNA polymeras fogar ihop

Replikations-maskineriet

🍴 Replikationsgaffeln är asymmetrisk

• Trots att replikation är bidirectional är själva gaffeln asymmetrisk.

• Detta är pga. polymeras som extenderar asymmetriskt (5’-3’)

🧬 Primas skapar primers för DNA polymeras

• Polymeras behöver alltid en primer

• Primas binder till ssDNA och börjar syntetisera RNA i en RNA:DNA hybrid.

• DNA polymeras kan sen använda RNA tillverkat av primas som primer.

🧬 DNA ligase sätter ihop Okazaki fragmenten på lagging strand

Sätter ihop = ligerar (ligation)

Replikations-maskineriet

☕️ Break 🚽

Andra enzymer

• Sliding clamp: processivity-promoting factor
  (DNA polymeras har låg processivitet av sig själv).

• Clamp loader: sätter fast sliding clamp till DNA.

Andra enzymer

• Topoisomeras: relaxerar supercoiled DNA skapat av helicas genom att göra nicks.

• SSB proteiner: Binder till ssDNA och förhindrar att det annealar tillbaka till dsDNA.
  Replication protein A (RPA) är ett exempel på ett SSB protein hos Eukaryoter.

🧬 The end-replication problem ⭕️

Bakterier löser detta genom att ha ⭕️ cirkulära genom.

Hur löser Eukaryoter detta?

🧬 The end-replication problem ⭕️

Telomerase

Hur funkar telomerase?

Hur funkar telomerase?

• I vissa arter, inklusive människor, binder enkelsträngade överhängar till komplementära upprepningar i närliggande dubbelsträngad DNA och skapar skyddande slingor vid telomerändarna.

• Telomer bryts långsamt ned under många celldelningscykler, vilket ger en skyddande buffert för de interna kromosomområden som bär generna. Den gradvisa förlusten av telomerer kan förklara varför celler bara kan dela sig ett visst antal gånger.

🧬 DNA reparation 🛠🧰

💧 Hydrolys av DNA 🧬

☢️☀️ UV-strålning av DNA 🧬

Single-stranded break repair

Mismatch repair (MMR)

🧬 Double-stranded break repair

• Non-homologous end-joining (NHEJ)
• Homologous recombination (HR)

Homologisk rekombination (HR)

Frågor? Diskussion?