Metoder för DNA-, RNA- och proteinanalys
🧬

Daniel Fürth
Assistant professor
SciLifeLab/Uppsala University

🔗 furthlab.xyz
@furthlab

📽 Presentationen finns online 🌎

Länk: 🔗www.furthlab.xyz/teaching

📚🙇🏽‍♀️🙇🏻‍♂️📖 Inlärningsmål

Ämnen som behandlas idag:

• 🧬 DNA och kloning:
  • Restriktionsenzymer och endonukleaser
  • Rekombinant DNA
  • Kloning
  • RNA och cDNA genom reverse transcription

☕️ PAUS

• 🧬 Analytiska tekniker för nukleinsyra:
  • Elektrofores
    
  • Hybridisering
  • PCR
  • Sanger sequencing
  • Next-generation sequencing

☕️ PAUS

• 🧬 Analytiska tekniker för proteiner:
  • Affinitets-baserade
  • Masspektrometri

🛠🧰 Restriktionsenzymer 🧬

🇺🇸 Restriction och modifikations-enzymer 🇨🇭

Nobelpris: 🇺🇸 Hamilton O. Smith, 🇺🇸 Daniel Nathans, and 🇨🇭 Werner Arber.

Left to right: 🇨🇭Grete Kellenberger, 🇨🇭 Werner Arber, 🇨🇭 Daisy Dussoix

🛠🧰 Restriktionsenzymer 🧬

• Blunt ends

• Sticky ends

Rekombinant DNA

Ligering av sticky och blunt ends

Kloning

DNA bibliotek

RNA och cDNA

Break

☕️

📚🙇🏽‍♀️🙇🏻‍♂️📖 Inlärningsmål

Ämnen som behandlas idag:

• 🧬 DNA och kloning:
  • Restriktionsenzymer och endonukleaser
  • Rekombinant DNA
  • Kloning
  • RNA och cDNA genom reverse transcription

☕️ PAUS

• 🧬 Analytiska tekniker för nukleinsyra:
  • Elektrofores
    
  • Hybridisering
  • PCR
  • Sanger sequencing
  • Next-generation sequencing

☕️ PAUS

• 🧬 Analytiska tekniker för proteiner:
  • Affinitets-baserade
  • Masspektrometri

Elektrofores och separationskemi

Electrophoretic machine as designed by Tiselius

Elektrofores

Agarose gel electrophoresis

Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)

• Length
• Charge
• Confirmation

Molecules can be run in their “native state”
preserving higher-order structure.

Or a chemical denaturant can be added to
remove structure (urea for 🧬).

Native vs non-native PAGE.

Pore size controled by % of acrylamide.

📏 Resolution:
100-1000 nt down to single-nucleotide.

DNA hybridisering

• Denaturering: separering av vätebindningar mellan dubbelstrandade nukleinsyror (DNA/RNA).
• Annealing: Vätebindninga skapas mellan två enkelsträngade (single strand) nukleinsyror (DNA/RNA).

Melting temperature: temperaturen då 50% av ett DNA duplex dissocierar och blir enkelstrandat (single stranded).

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Sanger sequencing

Dideoxynucleotides (ddNTP) inkorporeras av DNA polymeras

• Polymeras kan inkorporera ddNTPs (dideoxynukleotider) och inte enbart dNTPs (deoxynukleotider).

• Enbart en kvävebas inkorporeras, sen termineras polymeriseringen.

• Ingen fri 3’hydroxyl grupp (3’OH).

🏆 Chain-termination method 🏅

“Sanger sequencing”

Second Noble Prize

Next-generation sequencing

• Solid support: PCR bridge amplification
• Primer extension: Reversible dye-terminators (patent 444 about to expire!)

Next-generation sequencing

Next-generation sequencing

All about how to massively multiplex sequencing.

Solid-phase substrate

• Bridge amplification

Primer extension

• Sequencing by synthesis
  (SBS)
• Reversible dye-terminators

Democratization of sequencing

Break

☕️

Analytiska tekniker för proteiner

Affinitetsbaserade protein metoder

Dessa metoder är ej bra beskrivna i läroboken.

Antikroppar:

• Monokonala: härstammar från en och samma cellklon.
• Polyklonala: härstammar från flera cellkloner.

Western blot: Relativ mängd och molekylmassa kan läsas av från SDS-PAGE.

Immunohistochemistry (IHC): Binding av antikroppar direkt i vävnadssnitt (histologi) för visualisering under mikroskop.

ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Görs på plattor med en färgreaktion som indikerar koncentrationen av antigen. Eva Engvall och Peter Perlmann (1971), Stockholms Universitet.

Masspektrometri